在《Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples》一文中， 作者使用生信分析方法實(shí)現(xiàn)環(huán)境樣品中微生物群落豐度的絕對(duì)定量。

       文章中生物信息分析主要包括擴(kuò)增子分析、多維標(biāo)度分析和T檢驗(yàn)分析。

  1）擴(kuò)增子分析采用Usearch10，且采用Unoise3非聚類直接去噪生成ZOTUs(Zero-radius OTUs)，但該軟件的64位版本收費(fèi)，而免費(fèi)的32位版對(duì)數(shù)據(jù)分析量有限制。

  2）采用PRIMER6軟件進(jìn)行降維方法非度量多維標(biāo)度 (Non-metric Multidimensional scaling，NMDS)來(lái)分析兩組微生物群落結(jié)構(gòu)組成是否存在顯著差異。

  3）采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法中的T檢驗(yàn)并進(jìn)行Bonferroni 矯正來(lái)檢驗(yàn)兩組樣品之間物種組成是否存在顯著性差異。

擴(kuò)增子分析

分析步驟如下：

    1.擴(kuò)增子分析采用Usearch 10，且查找OTU使用非聚類算法unoise3(我們展示最新版本Usearch 11操作方法)；

    2.三類擴(kuò)增子注釋數(shù)據(jù)庫(kù)分別采用SILVA, PR2 and ITSone數(shù)據(jù)庫(kù)；

    3.擴(kuò)增子分析時(shí)，需先將PEF三種合成spikes的序列和注釋信息分別加入到各自數(shù)據(jù)庫(kù)中；

    4. 最終得到OTU代表序列需滿足各自的限定長(zhǎng)度。

Step1：Merge paired reads（雙端測(cè)序數(shù)據(jù)合并）

Step2：Strip primers （去除前后端引物片段）

Step3：Quality filter（質(zhì)控）

Step4：Find unique read sequences and abundances （去冗余）

Step5：Denoise: predict biological sequences and filter chimeras（查找ZOTUs&去嵌合體）

Step6：Make OTU table & Normalize to 5k reads for each sample（生成OTU table表并進(jìn)行均一化）

Step7：Predict taxonomy（對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種注釋）

Step8：Taxonomy summary reports（生成不同水平下的物種注釋匯總表）

  上述Usearch11的8個(gè)步驟已滿足本文獻(xiàn)中所有擴(kuò)增子分析需求，后續(xù)的分析均以Step6或Step8得到的Table表為基礎(chǔ)，通過(guò)格式轉(zhuǎn)化統(tǒng)計(jì)相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或通過(guò)比較合成spikes和某物種的相對(duì)豐度并結(jié)合加入spikes的實(shí)際含量，計(jì)算得出對(duì)應(yīng)物種絕對(duì)含量等，最后實(shí)現(xiàn)可視化(點(diǎn)圖/折線圖/柱狀圖等可利用R實(shí)現(xiàn))及美化(可采用Adobe Illustrator CS6軟件向結(jié)果圖添加其他元素)。

NMDS分析

分析步驟如下：

    1.軟件下載地址：https://www.primer-e.com/download/，安裝軟件，進(jìn)入操作界面

    2.點(diǎn)擊File上傳ZOTUs Table表，txt文件即可，選擇Data type，勾選基本屬性，導(dǎo)入物種豐度表

  3.點(diǎn)擊Pre-treatment→Transform(Overall)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，格式轉(zhuǎn)化，文章采用的是取平方根Square root

  4.點(diǎn)擊Analyse→Resemblance計(jì)算樣品間的距離矩陣，方法選擇Bray-Curtis similarity

  5.點(diǎn)擊Analyse→MDS→Non-metric MDS(nMDS)…，進(jìn)行非度量多維標(biāo)度（NMDS）分析

非度量多維標(biāo)度（NMDS）分析參數(shù)設(shè)置：建議參數(shù)選擇如下，其中Number of restarts迭代次數(shù)較重要，直接影響結(jié)果的可靠性，默認(rèn)值為50，操作文檔建議設(shè)置為100。結(jié)果展示如下，樣品間的距離越近，表示其物種組成越接近。

T檢驗(yàn)

為了比較兩種土壤特定物種的相對(duì)/絕對(duì)豐度是否存在顯著差異，文章采用了T檢驗(yàn)法并進(jìn)行Bonferroni多重檢驗(yàn)矯正，將最終矯正得到的p_value值（為了區(qū)分用q表示）作為是否存在顯著差異的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，在文章中“*”表示q< 0.05, “***”表示q < 0.01, “***”表示q < 0.001。

T檢驗(yàn)的R語(yǔ)言分析流程：

  Step1：安裝并載入分析需要的包

  Step2：讀入文件

  Step3：選擇要比較的兩組組（此處查看 group1 與 group2 的物種species_A 豐度是否存在顯著差異）

  Step4：驗(yàn)證數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布

  Step5：獨(dú)立樣本的 t 檢驗(yàn)

  Step6：Bonferroni多重檢驗(yàn)矯正

結(jié)果說(shuō)明：

  1.正態(tài)QQ圖：若所有的點(diǎn)都離直線很近，且落在置信區(qū)間內(nèi)（圖中虛線部分，默認(rèn)展示95%置信區(qū)間），即表明符合正態(tài)性假設(shè)，可進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。

2. 多重檢驗(yàn)矯正意義和原理：

(1) 當(dāng)同一個(gè)數(shù)據(jù)集有n次（n>=2）假設(shè)檢驗(yàn)時(shí)，通過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正可以大大減少假陽(yáng)性概率，多重檢驗(yàn)矯正方法包括“holm”, “hochberg”, “hommel”, “bonferroni”, “BH”, “BY”, “fdr”，其中bonferroni為最嚴(yán)格的矯正方法。

(2) Bonferroni校正原理是，如果在同一數(shù)據(jù)集上同時(shí)檢驗(yàn)n個(gè)獨(dú)立的假設(shè)，那么用于每一個(gè)假設(shè)的統(tǒng)計(jì)顯著水平為僅檢驗(yàn)一個(gè)假設(shè)時(shí)顯著水平的1/n。

以上就是該文獻(xiàn)生信分析方法體系的實(shí)現(xiàn)流程。