宏轉(zhuǎn)錄組從整體水平上研究某一特定環(huán)境，特定時(shí)期群體生命全部基因組轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以樣品中的全部RNA為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)錄水平上分析微生物群落中活躍菌種的組成及活性基因的表達(dá)。宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序避開未培養(yǎng)微生物的分離培養(yǎng)問題，能有效擴(kuò)展微生物資源的利用空間。

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程圖

　　分析內(nèi)容

　　1. 原始數(shù)據(jù)除雜及質(zhì)量評(píng)估

　　2. 差異表達(dá)分析

　　3. GO 分類

　　4. 代謝通路分析

　　5. 差異表達(dá)的 Unigene 的 GO 和 KEGG pathway 富集分析

　　6. 根據(jù)客戶需求可進(jìn)行個(gè)性化分析

　　樣品信息

　　1. 樣品類型： RNA；

　　2. 樣品濃度：≥ 20 ng/μL；

       3. 樣品質(zhì)量：OD 260/280應(yīng)在 1.8 到 2.2 之間，OD 260/230 ≥ 2.0，23S:16S ≥ 1.0；     

       4. 確保RNA無降解，無污染；

　　5. 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用干冰運(yùn)輸。

宏轉(zhuǎn)錄學(xué)分析泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌的基因表達(dá)

　　背景 (Background)

　　泡菜是通過發(fā)酵制成的一種韓國傳統(tǒng)食物。發(fā)酵過程中有多種乳酸產(chǎn)生，與其他環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)如土壤，海水或人類結(jié)腸相比，發(fā)酵食品如泡菜同樣具有復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)。

　　結(jié)果 (Results)

　　基于16S rRNA 的測(cè)序分析表明泡菜發(fā)酵過程中微生物生態(tài)系統(tǒng)主要是 6 種乳酸菌。在此結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)泡菜發(fā)酵期間五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行了宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，然后利用 MG-RAST 分析這些測(cè)序數(shù)據(jù)來揭示發(fā)酵期間宏轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜。首先利用MG-RAST將mRNA序列分配到代謝基因發(fā)現(xiàn)了碳水化合物代謝和乳酸發(fā)酵的普遍性。mRNA測(cè)序序列與六個(gè)乳酸菌菌株的基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵早期腸膜狀明串珠菌腸系膜細(xì)胞較為活躍，在后期則為米酒乳桿菌和魏斯氏桿菌較為活躍。許多參與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、水解和乳酸發(fā)酵相關(guān)的基因積極地表達(dá)，這是典型的異戊酸發(fā)酵。在所有明串珠菌屬物種中，尤其是腸膜狀明串菌都鑒定出甘露醇脫氫酶編碼基因(mdh)。甘露醇脫氫酶編碼基因的三個(gè)拷貝 (染色體上兩個(gè)拷貝，質(zhì)粒上一個(gè)拷貝) 具有不同的表達(dá)模式。這些結(jié)果有助于了解在發(fā)酵過程中的乳酸菌群體中的活性群體和基因表達(dá)。

　　原文: Jung, J. Y. et al. Metatranscriptomic analysis of lactic acid bacterial gene expression during kimchi fermentation. International journal of food microbiology, 163: 171-179(2013).

通過全部 RNA 和 pyrotag 測(cè)序研究北海硅藻水華中海洋浮游細(xì)菌的多樣性和活性

　　背景 (Background)

　　浮游植物總量占地球上光合生物量的比列不到1%，但浮游植物的凈初級(jí)生產(chǎn)量卻占到一半。有一小部分浮游植物會(huì)下沉到海底，被原生生物、橈足類、魚類以及浮游細(xì)菌快速消耗。浮游細(xì)菌在浮游植物的再循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，其中分解藻類生物量的細(xì)菌群落是多樣的，由不同的異養(yǎng)類群組成，具有不同的生態(tài)策略。然而關(guān)于這些細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)和功能相互之間的作用知之甚少。

　　結(jié)果 (Results)

　　在春季硅藻水華結(jié)束時(shí)，對(duì)德國的海岸線的浮游細(xì)菌群落進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果揭示了不同細(xì)菌類群的群落演替。宏基因組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明這些進(jìn)化枝的浮游細(xì)菌利用不同的底物光譜并消耗不同藻類底物。上述的方法提供了關(guān)于細(xì)菌群落組成和基因表達(dá)以及評(píng)估不同進(jìn)化枝浮游細(xì)菌代謝活動(dòng)水平新見解。研究者也發(fā)現(xiàn)最豐富的類群主要有FlavobacteriaAlphaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria。宏轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)與宏基因組數(shù)據(jù)比對(duì)證實(shí) Formosa 與 Polaribacter 是主要降解藻類的細(xì)菌，而 Rhodobacteraceae和 Reinekea spp 表現(xiàn)出較少的底物光譜。此外，研究也發(fā)現(xiàn)紅細(xì)菌和變形菌 SAR92 進(jìn)化支表現(xiàn)出高代謝活性水平，這表明這些進(jìn)化支細(xì)菌在硅藻水華期間發(fā)揮了重要的作用。

　　原文: Anna, K. et al. Diversity and activity of marine bacterioplankton during a diatombloom in the North Sea assessed by total RNA and pyrotag sequencing. Marine Genomics, 18:185–192(2014).

富營養(yǎng)淡水湖藍(lán)藻水華中次生代謝產(chǎn)物基因表達(dá)與細(xì)菌功能的相互作用

　　背景 (Background)

　　全球范圍內(nèi)有害藍(lán)藻水華的頻繁暴發(fā)，并且絕大多數(shù)水華藍(lán)藻會(huì)向水體釋放藍(lán)藻毒素，給動(dòng)物和人類的飲用水安全帶來極大的危害。該研究針對(duì)一個(gè)淺水富營養(yǎng)化蓄積池，該水庫長期經(jīng)歷有害藍(lán)藻水華。該研究的目的是鑒定水庫中微囊藻和其他主要物種在晝夜更替下的基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化和差異性，洞察能夠影響水體質(zhì)量的毒素合成和部分營養(yǎng)、能量循環(huán)相關(guān)的功能。

　　結(jié)果 (Results)

　　在所有樣品中來自微囊藻的轉(zhuǎn)錄物占主導(dǎo)地位，并且伴有至少533個(gè)屬水平上藍(lán)細(xì)菌，變形桿菌，擬桿菌和放線菌的轉(zhuǎn)錄本。在微囊藻群體內(nèi)，很多轉(zhuǎn)錄本是與浮力、光合作用和毒素合成的相關(guān)的，表明這些是水庫中競爭優(yōu)勢(shì)所必需的。白天，微囊藻轉(zhuǎn)錄物富集途徑包括光合作用和能量代謝，而在晚上富集途徑包括DNA復(fù)制和修復(fù)，毒素的生物合成。微囊藻轉(zhuǎn)錄物的主要來源是聚酮化合物和非核糖體肽合酶(分別為PKS和NRPS)基因簇。在整個(gè)晝夜周期內(nèi)，所有PKS/ NRPS基因簇的表達(dá)都會(huì)發(fā)生，轉(zhuǎn)錄物包括毒素微囊藻毒素和綠膿毒素。來自微囊藻的表達(dá)的PKS / NRPS基因簇與任何已知的產(chǎn)物都無關(guān)。水庫中四個(gè)豐富的門富集了不同的功能，包括光合作用(藍(lán)細(xì)菌)，復(fù)雜有機(jī)分子(變形菌)的分解，糖基代謝(擬桿菌)和植物碳水化合物如纖維二糖(放線菌)的分解。這些結(jié)果提供了在有害藻類水華中有關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因表達(dá)評(píng)估，功能分配和功能的相互作用。

　　原文: Kevin, P. et al. Secondary metabolite gene expression and interplay of bacterial functions in a tropical freshwater cyanobacterial bloom. ISME Journal, 8:1866–1878(2014).

1. 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序取樣有哪些注意事項(xiàng)?

　　要注意避免 RNA 酶的污染，取樣的所需耗材和器具等都需要 RNAase-free 處理，樣品液氮速凍，干冰寄送，避免反復(fù)凍融。